血紅蛋白的提取和分離：

1、實驗原理
蛋白質的物化理性質：形狀、大小、電荷性質和多少、溶解度、吸附性質、親和力等千差萬別，由此提取和分離各種蛋白質。
（1）凝膠色譜法（分配色譜法）：
①原理：分子量大的分子通過多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流動快；分子量小的分子穿過多孔凝膠顆粒內部，路程長，流動慢。
②凝膠材料：多孔性，多糖類化合物，如葡聚糖、瓊脂糖。

③分離過程：
混合物上柱→洗脫→大分子流動快、小分子流動慢→收集大分子→收集小分子
洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖液，促使蛋白質分子的差速流動。
④作用： 分離蛋白質，測定生物大分子分子量，蛋白質的脫鹽等。
（2）緩沖溶液
①原理：由弱酸和相應的強堿弱酸鹽組成（如H₂CO₃?NaHCO₃， NaH₂PO₄/Na₂HPO₄等），調節(jié)酸和鹽的用量，可配制不同pH的緩沖液。
②緩沖液作用：抵制外界酸、堿對溶液pH的干擾而保持pH穩(wěn)定。
(3）凝膠電泳法：
①原理：不同蛋白質的帶電性質、電量、形狀和大小不同，在電場中受到的作用力大小、方向、阻力不同，導致不同蛋白質在電場中的運動方向和運動速度不同。
②分離方法：瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。
③分離過程：在一定pH下，使蛋白質基團帶上正電或負電；加入帶負電荷多的SDS，形成“蛋白質?SDS復合物”，使蛋白質遷移速率僅取決于分子大小。
2、實驗步驟
（1）樣品處理
① 紅細胞的洗滌
洗滌紅細胞的目的是去除雜蛋白，采集的血樣要及時采用低速短時間離心分離紅細胞，然后用膠頭吸管吸出上層透明的黃色血漿，將下層暗紅色的紅細胞液體倒入燒杯，再加入五倍體積的生理鹽水，緩慢攪拌10min，低速短時間離心，如此重復洗滌三次，直至上清液中沒有黃色，表明紅細胞已洗滌干凈。
②血紅蛋白的釋放
在蒸餾水和甲苯作用下，紅細胞破裂釋放出血紅蛋白。
注：加入蒸餾水后紅細胞液體積與原血液體積要相同。加入甲苯的目的是溶解細胞膜，有利于血紅蛋白的釋放和分離。
（2）粗分離
①分離血紅蛋白溶液
將攪拌好的混合溶液離心后，試管中的溶液分為4層。第一層為無色透明的甲苯層，第2層為白色薄層固體，是脂溶性物質的沉淀層，第3層是紅色透明液體，這是血紅蛋白的水溶液，第4層是其他雜質的暗紅色沉淀物。將試管中的液體用濾紙過濾，除去之溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。
②透析
取1mL的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300mL的物質的量的濃度為20mmol/L的磷酸緩沖液中，透析12h。透析可以去除樣品中分子量較小的雜質，或用于更換樣品的緩沖液。
（3）純化：調節(jié)緩沖液面→加入蛋白質樣品→調節(jié)緩沖液面→洗脫→收集分裝蛋白質
（4）純度鑒定??SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳


知識點撥：

注意事項
（1）電泳技術
電泳技術就是在電場的作用下，利用待分離樣品中各種分子帶電性質以及分子本身大小、形狀等性質的差異，使帶電分子產生不同的遷移速度，從而達到對樣品進行分離、鑒定或提純的目的。
（2）紅細胞的洗滌
如果分層不明顯，可能是洗滌次數少、未能除去血漿蛋白的原因。此外，離心速度過高和時間過長，會使白細胞和淋巴細胞一同沉淀，也得不到純凈的紅細胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。
（3）如何檢測凝膠色譜柱的裝填是否成功
由于凝膠是一種半透明的介質，因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。
此外，還可以加入大分子的有色物質，觀察色帶移動的情況。如果色帶均勻、狹窄、平整，說明凝膠色譜柱的性能良好。如果色譜柱出現紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體以消除氣泡，消除不了時要重新裝柱。
（4）為什么凝膠的裝填要緊密、均勻？
如果凝膠裝填得不夠緊密、均勻，就會在色譜柱內形成無效的空隙，使本該進入凝膠內部的樣品分子從這些空隙中通過，攪亂洗脫液的流動次序，影響分離的效果。
（5）沸水浴處理加入洗脫液的濕凝膠的目的
不但節(jié)約時間，還能除去凝膠中可能帶有的微生物和排除凝膠內的空氣。
（6）G-75
“G”代表凝膠的交聯程度，膨脹程度及分離范圍，75表示凝膠得水值，即每克凝膠膨脹時吸水7.5g。
（7）裝填完后，立即用洗脫液洗脫的目的：使凝膠裝填緊密
（8）加入檸檬酸鈉有何目的？為什么要低速、短時離心？為什么要緩慢攪拌？
防止血液凝固；防止白細胞沉淀；防止紅細胞破裂釋放出血紅蛋白。
（9）與其他真核細胞相比，紅細胞的特點及這一特點對進行蛋白質的分離的意義
哺乳動物及人的成熟的紅細胞是雙面凹圓餅狀，沒有細胞核和細胞器。其含有的血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜分離時可以通過觀察顏色來判斷什么時候應該收集脫液。這使血紅蛋白的分離過程非常直觀，大大簡化了實驗操作。
（10）如何檢測血紅蛋白的分離是否成功
如果凝膠色譜柱裝填得很成功、分離操作也正確的話，能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整，隨著洗脫液緩慢流出；如果紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，說明分離的效果不好，這與凝膠色譜柱的裝填有關。

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