【實(shí)驗(yàn)一】 生物組織中還原糖、脂肪、蛋白質(zhì)的鑒定
一、目的
初步掌握鑒定生物組織中還原糖、脂肪、蛋白質(zhì)的基本方法。
二、建議
教材中本實(shí)驗(yàn)安排為驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，有條件的學(xué)�？梢愿臑樘剿餍詫�(shí)驗(yàn)，安排在講課之前，或與講課同步進(jìn)行。
本實(shí)驗(yàn)難度并不大，但內(nèi)容較多，實(shí)驗(yàn)時(shí)間較長(zhǎng)，因此，必須作周密安排，才能按時(shí)完成。實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意以下幾點(diǎn)。
1.增設(shè)教師演示實(shí)驗(yàn)。上課之前，教師應(yīng)該準(zhǔn)備好做演示實(shí)驗(yàn)所需的實(shí)驗(yàn)材料、用具、儀器和試劑等。同時(shí)，逐項(xiàng)完成還原糖、脂肪、蛋白質(zhì)3類有機(jī)物的鑒定實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)課上，將3個(gè)實(shí)驗(yàn)的正確結(jié)果分別展示在講臺(tái)上，并作扼要的介紹，以便使學(xué)生將自己的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與教師的演示實(shí)驗(yàn)作比較。
2.實(shí)驗(yàn)中學(xué)生應(yīng)分工合作。在“還原糖的鑒定”實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)每組兩個(gè)學(xué)生中的一個(gè)制備生物組織樣液時(shí)，另一個(gè)學(xué)生可以用酒精燈將水煮開，以便縮短實(shí)驗(yàn)的等待時(shí)間。在“脂肪的鑒定”實(shí)驗(yàn)中，一個(gè)學(xué)生制作臨時(shí)裝片時(shí)，另一個(gè)學(xué)生則可以調(diào)試顯微鏡。另外，在完成前兩個(gè)實(shí)驗(yàn)時(shí)，一個(gè)學(xué)生洗刷試管、清洗玻片和整理顯微鏡，另一個(gè)學(xué)生則可以進(jìn)行后一個(gè)實(shí)驗(yàn)的操作。
3.關(guān)于鑒定還原糖的實(shí)驗(yàn)，在加熱試管中的溶液時(shí)，應(yīng)該用試管夾夾住試管上部，并放入盛開水的大燒杯中加熱。注意試管底部不要接觸燒杯底部，同時(shí)試管口不要朝向?qū)嶒?yàn)者，以免試管內(nèi)溶液沸騰時(shí)沖出試管，造成燙傷。如果試管內(nèi)溶液過于沸騰，可以上提試管夾，使試管底部離開大燒杯中的開水。
4.做鑒定還原糖和蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)時(shí)，在鑒定之前，可以留出一部分樣液，以便與鑒定后的樣液的顏色變化作對(duì)比，這樣可以增強(qiáng)說服力。
5.斐林試劑的甲液和乙液混合均勻后方可使用，切勿將甲液和乙液分別加入組織樣液中。

三、參考資料
還原糖的鑒定原理 生物組織中普遍存在的還原糖種類較多，常見的有葡萄糖、果糖、麥芽糖。它們的分子內(nèi)都含有還原性基團(tuán)（游離醛基或游離酮基），因此叫做還原糖。蔗糖的分子內(nèi)沒有游離的半縮醛羥基，因此叫做非還原性糖，不具有還原性。本實(shí)驗(yàn)中，用斐林試劑只能檢驗(yàn)生物組織中還原糖存在與否，而不能鑒定非還原性糖。
斐林試劑由質(zhì)量濃度為0.1 g／mL的氫氧化鈉溶液和質(zhì)量濃度為0.05　g／mL的硫酸銅溶液配制而成，二者混合后，立即生成淡藍(lán)色的Cu(OH)2沉淀。Cu(OH)2與加入的葡萄糖在加熱的條件下，能夠生成磚紅色的Cu2O沉淀，而葡萄糖本身則氧化成葡萄糖酸。其反應(yīng)式如下：
CH2OH?(CHOH)4?CHO＋2Cu(OH)2→CH2OH?(CHOH)4?COOH＋Cu2O↓＋2H2O
用斐林試劑鑒定還原糖時(shí)，溶液的顏色變化過程為：淺藍(lán)色棕色磚紅色(沉淀)。
蛋白質(zhì)的鑒定原理 鑒定生物組織中是否含有蛋白質(zhì)時(shí)，常用雙縮脲法，使用的是雙縮脲試劑。雙縮脲試劑的成分是質(zhì)量濃度為0.1 g／mL的氫氧化鈉溶液和質(zhì)量濃度為0.01 g／mL的硫酸銅溶液。在堿性溶液(NaOH)中，雙縮脲(H2NOC?NH?CONH2)能與Cu2+作用，形成紫色或紫紅色的絡(luò)合物，這個(gè)反應(yīng)叫做雙縮脲反應(yīng)。由于蛋白質(zhì)分子中含有很多與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似的肽鍵，因此，蛋白質(zhì)可與雙縮脲試劑發(fā)生顏色反應(yīng)。
用于鑒定還原糖的實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備植物組織是常用的實(shí)驗(yàn)材料，但必須加以選擇。在雙子葉植物中，光合作用的主要產(chǎn)物葡萄糖形成后，合成為淀粉，暫時(shí)儲(chǔ)藏在葉子內(nèi)，因此最好不用雙子葉植物的葉子作實(shí)驗(yàn)材料。有些單子葉植物，如韭菜、鳶尾，并不將光合作用的初始產(chǎn)物轉(zhuǎn)變?yōu)榈矸�，因此葉內(nèi)含有大量的可溶性單糖，但是，由于葉片中葉綠素的顏色較深，對(duì)于鑒定時(shí)的顏色反應(yīng)起著掩蓋作用，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象不明顯，因此，也不宜用單子葉植物的葉子作實(shí)驗(yàn)材料。
本實(shí)驗(yàn)最理想的實(shí)驗(yàn)材料是還原糖含量較高的植物組織(或器官)，而且組織的顏色較淺或近于白色的，如蘋果和梨的果實(shí)。經(jīng)試驗(yàn)比較，顏色反應(yīng)的明顯程度依次為蘋果、梨、白色甘藍(lán)葉、白蘿卜。
用于鑒定脂肪的實(shí)驗(yàn)材料 準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)材料最好選擇富含脂肪的種子，如花生種子(取其子葉)。供實(shí)驗(yàn)用的花生種子，必須提前浸泡3～4 h。浸泡時(shí)間短了，不容易切成片；浸泡時(shí)間過長(zhǎng)，則組織太軟，切下的薄片不易成形。
做鑒定脂肪的實(shí)驗(yàn)，教師可根據(jù)本地區(qū)的情況選用蘇丹Ⅲ或蘇丹Ⅳ染液。蘇丹Ⅲ染液遇脂肪的顏色反應(yīng)為橘黃色，蘇丹Ⅳ染液遇脂肪的顏色反應(yīng)為紅色。因蘇丹Ⅳ染液與脂肪的親和力比較強(qiáng)，所以，染色的時(shí)間應(yīng)比較短，一般為1 min左右。用于鑒定蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備 實(shí)驗(yàn)材料最好選用富含蛋白質(zhì)的生物組織(或器官)，植物材料常用的是大豆種子，動(dòng)物材料常用的是雞蛋(卵白)。如用大豆種子，必須提前浸泡1～2 d，這樣容易研磨成漿。有條件的學(xué)校，可以直接采用現(xiàn)成的大豆磨成的豆?jié){，豆?jié){可以購(gòu)買，也可用小型的研磨機(jī)制取。利用豆?jié){作實(shí)驗(yàn)材料，可以節(jié)約實(shí)驗(yàn)時(shí)間。
如果用稀釋的卵白作實(shí)驗(yàn)材料，效果會(huì)更好。

斐林試劑的配制

甲液質(zhì)量濃度為0.1 g／mL的氫氧化鈉溶液

乙液質(zhì)量濃度為0.05 g／mL的硫酸銅溶液

使用時(shí)臨時(shí)配制，將4～5滴乙液滴入2 mL甲液中，配完后立即使用。

蘇丹Ⅲ溶液的配制 稱取0.1 g蘇丹Ⅲ干粉，溶于100 mL體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精中，待全部溶解后再使用。

蘇丹Ⅳ溶液的配制 稱取0.1 g蘇丹Ⅳ干粉，溶于50 mL丙酮中，再加入體積分?jǐn)?shù)為70%的酒精50 mL，充分混合后即可使用。

雙縮脲試劑的配制 取10 g氫氧化鈉放入容量瓶（或有刻度的燒杯）中，加水至100 mL，待充分溶解后倒入試劑瓶中，配成質(zhì)量濃度為0.1 g／mL的氫氧化鈉溶液，瓶口塞上膠塞，貼上標(biāo)簽，寫上試劑A。

取1 g硫酸銅放入容量瓶（或有刻度的燒杯）中，加水至100 mL，待充分溶解后倒入試劑瓶中，配成質(zhì)量濃度為0.01 g／mL的硫酸銅溶液(藍(lán)色)。瓶口塞上膠塞，貼上標(biāo)簽，寫上試劑B。


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