微生物的實驗室培養(yǎng)：

1．培養(yǎng)基的概念、種類及營養(yǎng)構(gòu)成
(1)概念：人們按照微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配制出的供其生長繁殖的營養(yǎng)基質(zhì)。

(3)營養(yǎng)構(gòu)成：各種培養(yǎng)基一般都含有水、碳源、氮源、無機鹽，此外還要滿足微生物生長對pH、特殊營養(yǎng)物質(zhì)以及氧氣的要求。
2．無菌技術(shù)
(1)關(guān)鍵：防止外來雜菌的入侵。
(2)具體操作
①對實驗操作的空間、操作者的衣著和手進行清潔和消毒。
②將用于微生物培養(yǎng)的器皿、接種用具和培養(yǎng)基等進行滅菌。
③為避免周圍環(huán)境中微生物的污染，實驗操作應(yīng)在酒精燈火焰附近進行。
④實驗操作時應(yīng)避免已經(jīng)滅菌處理的材料用具與周圍的物品接觸。
(3)消毒和滅菌

	消毒	滅菌
概念	使用較為溫和的物理或化學(xué)方法殺死物體表面或內(nèi)部的部分微生物（不包芽孢和孢子）	使用強烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所用的微生物（包括芽孢和孢子）
常用方法	煮沸消毒法、巴氏消毒法、化學(xué)藥劑消毒法、紫外線消毒法	灼燒滅菌、干熱滅菌、高壓蒸汽滅菌
適用對象	操作空間、某些液體、雙手等	接種環(huán)、接種針、玻璃器皿、培養(yǎng)基等

3、制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基的方法：計算、稱量、溶化、滅菌、倒平板。
4、接種方法：平板劃線法和稀釋涂布法。
（1）平板劃線操作：
①挑取他含菌樣品：選用平整、圓滑的接種環(huán)，按無菌操作法挑取少量菌種。
②劃A區(qū)：將平板倒置于煤氣（酒精）燈旁,左手拿出皿底并盡量使平板垂直于桌面，有培養(yǎng)基一面向著煤氣燈（這時皿蓋朝上，仍留在煤氣燈旁)，右手拿接種環(huán)先在A區(qū)劃3?4條連續(xù)的平行線(線條多少應(yīng)依挑菌量的多少面定）。劃完A區(qū)后應(yīng)立即燒掉環(huán)上的殘菌，以免因菌過多而影響后面各區(qū)的分離效果。在燒接種環(huán)時，左手持皿底并將其覆蓋在皿蓋上方(不要放入皿蓋內(nèi))，以防止雜菌的污染。
③劃其他區(qū)：將燒去殘菌后的接種環(huán)在平板培養(yǎng)基邊緣冷卻一下，并使B區(qū)轉(zhuǎn)到上方，接種環(huán)通過A區(qū)（菌源區(qū)）將菌帶到B區(qū)，隨即劃數(shù)條致密的平行線。再從B區(qū)作C區(qū)的劃線。最后經(jīng)C區(qū)作D區(qū)的劃線，D區(qū)的線條應(yīng)與A區(qū)平行，但劃D區(qū)時切勿重新接觸A、B區(qū)，以免極該兩區(qū)中濃密的菌液帶到D區(qū)，影響單菌落的形成。隨即將皿底放入皿蓋中。燒去接種環(huán)上的殘菌。
④等平板凝固后，將平板倒置。
（2）稀釋涂布法：是將菌液進行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面，在適宜條件下培養(yǎng)。在稀釋度足夠高的菌液里，聚集在一起的微生物將被分散成單個細(xì)胞，從而能在培養(yǎng)基表面形成單個的菌落。能夠測定樣品中活菌數(shù)的方法是：稀釋涂布平板法。


純化大腸桿菌的無菌操作和菌種保存：

1．大腸桿菌
(1)特性：革蘭氏陰性、兼性厭氧的腸道桿菌。
(2)用途：是基因工程技術(shù)中被廣泛采用的工具。
2．制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基
(1)計算：依據(jù)是培養(yǎng)基配方的比例。
(2)稱量：牛肉膏比較黏稠，可同稱量紙一塊稱取。牛肉膏和蛋白胨易吸潮，稱取時動作要迅速，稱后及時蓋上瓶蓋。
(3)溶化：牛肉膏和稱量紙+水加熱取出稱量紙→加蛋白胨和氯化鈉→加瓊脂（注意：要不斷用玻璃棒攪拌，防止瓊脂糊底而導(dǎo)致燒杯破裂）→補加蒸餾水至100mL。

3.純化大腸桿菌
（1）方法
①平板劃線法：通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基表面。
②稀釋涂布平板法：將駿業(yè)進行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面，進行培養(yǎng)。
（2）鑒定：將接種后的培養(yǎng)基和一個未接種的培養(yǎng)基（對照組）都放入到37℃恒溫箱中，培養(yǎng)12h和24h后，分別觀察并記錄結(jié)果。
（3）菌種保存

	臨時保存法	甘油管藏法
適用對象	頻繁使用的菌種	長期保存的菌種
培養(yǎng)及類型	固體斜面培養(yǎng)基	液體培養(yǎng)基
溫度	4℃	-20℃
方法	菌落長成后于冰箱中保存，每3～6個月將菌種從舊的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基上	將培養(yǎng)的菌液與等體積滅菌后的甘油混合均勻后于冷凍箱內(nèi)保存
缺點	菌種易被污染或產(chǎn)生變異	\\

知識點撥：

1、無菌技術(shù)操作原則：
（1）操作前準(zhǔn)備：
①操作環(huán)境應(yīng)清潔、寬敞、定期消毒；物品布局合理；無菌操作前半小時應(yīng)停止清掃工作、減少走動、避免塵土飛揚。
②工作人員應(yīng)做好個人準(zhǔn)備，戴好帽子、口罩，修剪指甲并洗手，必要時穿無菌衣、帶無菌手套。
（2）操作中保持無菌
①工作人員應(yīng)面向無菌區(qū)，手臂應(yīng)保持在腰部或操作臺臺面以上，不可跨越無菌區(qū)避免面對無菌區(qū)談笑、咳嗽、打噴嚏。
②用無菌持物鑷取用物品；無菌物品一經(jīng)取出，即使未用，也不可放回?zé)o菌容器內(nèi)；一套無菌物品僅供一位患者使用，避免交叉感染。 ③無菌操作中，無菌物品疑有污染或已被污染，應(yīng)予更換并重新滅菌。
（3）無菌物品保管：
①無菌物品必須與非無菌物品分開放置。
②無菌物品不可暴露于空氣中，應(yīng)存放于無菌包或無菌容器中，無菌包外須標(biāo)明物品名稱、滅菌日期，并按失效期先后順序排放。
③定期檢查無菌物品的滅菌日期及保存情況。無菌包在未被污染的情況下保存期一般為7天，過期或受潮應(yīng)重新滅菌。
2、劃線分離操作中的有關(guān)問題：
（1）在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)，在劃線操作結(jié)束時，仍然需要灼燒接種環(huán)。

	第一次灼燒	每次劃線之前灼燒	劃線結(jié)束灼燒
目的	避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)基	殺死上次劃線結(jié)束后接種環(huán)上殘留的菌種	殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染或感染操作者

②在灼燒接種環(huán)之后，要等其冷卻后再進行劃線，以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。
③在進行第二次以及其后的劃線操作時'要從上一次劃線的末端開始劃線。每次劃線后，線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個細(xì)菌繁殖而來的菌落。
(2)進行恒溫培養(yǎng)時，要將培養(yǎng)皿倒置的原因如果正放培養(yǎng)皿，則皿蓋上形成的水滴會落入培 養(yǎng)基表面并且擴散開。如果培養(yǎng)皿中已形成菌落，則茵落中的細(xì)菌會隨水?dāng)U散，菌落間相互影響，很難再分成單菌落，達不到分離的目的。因此恒溫培養(yǎng)時，培養(yǎng)皿必須倒置。
(3)培養(yǎng)后判斷是否有雜菌污染的方法
①從菌落的形態(tài)看，是否濕潤、透明、黏稠，呈何種顏色等等，是區(qū)別細(xì)菌、酵母菌、放線菌和霉菌的關(guān)鍵指標(biāo)。
②用顯微鏡鏡檢觀察其形態(tài)、大小，看是否有菌絲、孢子、芽孢等，這也是區(qū)別細(xì)菌、酵母菌、放線菌和霉菌的關(guān)鍵指標(biāo)。

知識拓展：

1、對異養(yǎng)微生物來說，含C、N的化合物既是碳源，也是氮源，即有些化合物作為營養(yǎng)要素成分時并不是起單一方面的作用。
2、并不是所有微生物都需添加特殊營養(yǎng)物質(zhì)，有些微生物需添加，原因是它們自身缺乏合成這些物質(zhì)所需要的酶或合成能力有限。
3、含抗生素的牛奶不能發(fā)酵為酸奶的原因：牛奶發(fā)酵成酸奶是利用乳酸菌來完成的，乳酸菌屬于細(xì)菌，
4、化學(xué)藥劑的消毒方法，其作用原理是使細(xì)菌體內(nèi)蛋白質(zhì)變性，但是化學(xué)物質(zhì)很難透過孢子或芽孢的堅硬外層進入細(xì)胞內(nèi)，因此化學(xué)方法難以消滅孢子和芽孢。
5、體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇?xì)⒕�效果最強，濃度過低，殺菌力弱，濃度過高，使菌體表面蛋白質(zhì)凝固形，成一層保護膜，乙醇分子不能滲入其內(nèi)，因此殺菌效果受影響。
6、倒平板的方法：右手持盛培養(yǎng)基的試管或三角瓶置火焰旁邊，用左手將試管塞或瓶塞輕輕地?fù)艹�，試管或瓶口保持對著火焰；然后用右手手掌邊緣或小指與無名指夾住管（瓶）塞（也可將試管塞或瓶塞放在左手邊緣或小指與無名指之間夾住。如果試管內(nèi)或三角瓶內(nèi)的培養(yǎng)基一次用完，管塞或瓶塞則不必夾在手中）。左手拿培養(yǎng)皿并將皿蓋在火焰附近打開一縫，迅速例入培養(yǎng)基約15mL，加蓋后輕輕搖動培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基均勻分布在培養(yǎng)皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即為平板。
7、在斜面培養(yǎng)基上接種時，其正確的操作順序：
①用左手大拇指、食指和無名指夾住菌種試管和待接種的斜面試管，管口并齊，使斜面向上成水平狀態(tài)
②右手?jǐn)Q松棉塞，但不取下
③右手拿接種環(huán)，在火焰上灼燒滅菌
④在火焰邊用右手無名指和小指夾兩個棉塞，將它們?nèi)∠�，同時左腕轉(zhuǎn)動，灼燒管口一周
⑤將接種環(huán)伸入管內(nèi)，讓環(huán)先接觸培養(yǎng)基上未長菌的部位，使環(huán)冷卻，然后輕輕挑取少量菌體
⑥在火焰旁邊迅速將沾有菌體的接種環(huán)伸到培養(yǎng)基的底部，由里向外輕輕畫蛇形細(xì)線
⑦抽出接種環(huán)，再用火焰灼燒管口，并在火焰上方將棉塞塞上
8、自養(yǎng)型微生物與異養(yǎng)型微生物的培養(yǎng)基的主要差別在于碳源。
9、平菇培養(yǎng)的操作程序：配制棉籽殼培養(yǎng)基，高壓蒸汽滅菌，接種，培養(yǎng)。
10、菌種的保存：對于頻繁使用的菌種，可以采用臨時保藏的方法；臨時保藏的菌種一般是接種到試管的固體斜面培養(yǎng)基上；臨時保藏的菌種容易被污染或產(chǎn)生變異；在臨時保藏過程中，每3～6個月都要重新將菌種從舊的培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)移到新鮮的培養(yǎng)基上；

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