第2講 酶母細(xì)胞的固定化
【重難點(diǎn)突破】
一、如何理解固定化酶的作用和原理？
1．酶的催化活性依賴于酶的空間結(jié)構(gòu)及活性中心。所以在固定化要選擇適當(dāng)條件，力圖不使其活性中心的基團(tuán)受到影響。
2．酶固定化的方法很多，目前采用的固定化技術(shù)大致可分為三類：載體結(jié)合法(包括共價(jià)鍵結(jié)合法、離子結(jié)合法、物理吸附法)、交聯(lián)法和包埋法。上述幾種方法也可并用，稱為混合法。
(1)載體結(jié)合法：利用共價(jià)鍵、離子鍵和物理吸附法把酶固定在纖維素、瓊脂糖、多孔玻璃和離子交換樹脂等載體的固定化處。
(2)交聯(lián)法：交聯(lián)法是利用雙功能試劑的作用，在酶分子之間發(fā)生交聯(lián)，凝集成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)而制成的固定化酶。酶蛋白中的游離基團(tuán)(如氨基、巰基等)可參與交聯(lián)反應(yīng)。
(3)包埋法：包埋法是將酶包埋在聚合物凝膠的微細(xì)網(wǎng)絡(luò)中或被半透性的聚合物膜所包圍，使酶分子不能從凝膠的網(wǎng)絡(luò)中或膜中漏出，而小分子的底物和產(chǎn)物則可以自由通過凝膠網(wǎng)格和半透膜。
3．固定化酶應(yīng)用實(shí)例
將葡萄糖異化酶固定在果顆狀載體上→放入底部有許多小孔的反應(yīng)柱(酶顆粒不能通過，反應(yīng)液能通過)→葡萄糖溶液從反應(yīng)柱上端注入→流經(jīng)反應(yīng)柱→與葡萄糖異構(gòu)酶接觸→果糖從反應(yīng)柱下端流出。
4.對(duì)固定化酶的理解：可以使反應(yīng)過程管道化、自動(dòng)化，產(chǎn)物易從反應(yīng)液中回收；酶的穩(wěn)定性有所改進(jìn)；酶的使用效率提高。
【典題演示1】
1. (2010蘇南四市一模)固定化酶是從20世紀(jì)60年代迅速發(fā)展起來的一種技術(shù)�？蒲腥藛T用海藻酸鈉作為包埋劑來固定小麥酯酶，以研究固定化酶的相關(guān)性質(zhì)和最佳固定條件。酶活力為固定化酶催化化學(xué)反應(yīng)的總效率，包括酶活性和酶的數(shù)量。下圖甲、乙、丙為部分研究結(jié)果。下列有關(guān)敘述中，錯(cuò)誤的是


A．由甲圖可知，固定化酯酶比游離酯酶對(duì)溫度變化適應(yīng)性更強(qiáng)
B．由乙圖可知，濃度為3%的海藻酸鈉包埋效果最好
C．由丙圖可知，固定化酯酶一般可重復(fù)使用3次，之后若繼續(xù)使用則酶活力明顯下降
D．固定化酶的酶活力較高，主要原因是增加了酶與底物的接觸面積
【答案】D
【解析】正確掌握固定酶的特性和識(shí)別圖形是突破口。甲圖可以看出在50度時(shí)游離酶的活性已經(jīng)很低，但是固定酶的活性依然很高，可以判定固定酶的溫度適應(yīng)范圍廣；乙圖反應(yīng)的時(shí)海藻酸鈉的濃度與酶活力的關(guān)系，可以看出濃度為3%時(shí)，酶活力最高；丙圖可以看出使用三次以后酶活力明顯下降；固定化酶與底物的基礎(chǔ)面積減少。
【變式訓(xùn)練1】
1. 下列不屬于固定化酶在利用時(shí)的特點(diǎn)的是 （ ）
A．有利于酶與產(chǎn)物分離
B．可以被反復(fù)利用
C．能自由出入依附的載體
D．一種固定化酶一般情況下不能催化一系列酶促反應(yīng)
【答案】C
【解析】掌握固定酶的知識(shí)時(shí)突破口。固定酶是把酶固定在特殊材料上，不能自由出入依附的載體。
【變式訓(xùn)練2】（09江蘇高考生物）下列關(guān)于固定化酶和固定化細(xì)胞的敘述，正確的是（ ）
A．固定化細(xì)胞技術(shù)在多步連續(xù)催化反應(yīng)方面優(yōu)勢(shì)明顯
B．固定化酶的應(yīng)用中，要控制好pH、溫度和溶解氧
C．利用固定化酶降解水體中有機(jī)磷農(nóng)藥，需提供適宜的營(yíng)養(yǎng)條件
D．利用固定化酵母細(xì)胞進(jìn)行發(fā)酵，糖類的作用只是作為反應(yīng)底物
【答案】A
【解析】本題對(duì)固定化酶和固定化細(xì)胞進(jìn)行發(fā)散考查，固定化酶發(fā)揮作用，與溶解氧無關(guān)，B選項(xiàng)錯(cuò)；固定化酶不屬于生物，不需要提供營(yíng)養(yǎng)，而固定化細(xì)胞進(jìn)行生命活動(dòng)，是需要營(yíng)養(yǎng)的，C選項(xiàng)錯(cuò)；糖類既是酵母菌作用的底物，也是微生物培養(yǎng)所需碳源。
【變式訓(xùn)練3】、下列有關(guān)固定化技術(shù)的敘述，正確的是（ ）
A．固定化酶只是在細(xì)胞內(nèi)才能發(fā)揮作用 B．固定化酶能提高酶的利用率
C．酶的固定是酶分離純化的常用方法 D．固定化酶的固定化方式就是吸附在固體表面上。
【答案】B
【解析】本題主要考查固定化酶的相關(guān)知識(shí)�？季V中的能力要求是A級(jí)。理解固定化技術(shù)的原理及優(yōu)點(diǎn)是本題的解題突破口。制成固定化酶的步驟是：酶的生產(chǎn)、提取、酶的分離純化、酶的固定化，制成固定化酶的方法有吸附在固體表面，有將酶相互連接起來．將酶包埋在細(xì)微的網(wǎng)格里等；這樣的固定化酶能重復(fù)利用，從而提高了酶的利用率；而酶在條件適宜時(shí)，既可在細(xì)胞內(nèi)起作用，也能在細(xì)胞外起作用，制成的固定化酶，更是主要在細(xì)胞外發(fā)揮作用。
二 如何理解固定化細(xì)胞的作用和原理？
1、固定化微生物細(xì)胞利用微生物來生產(chǎn)酶，具有生產(chǎn)成本低、周期短、產(chǎn)量大等優(yōu)點(diǎn)。微生物產(chǎn)生的酶，可以分為分泌在細(xì)胞外的胞外酶和包含在細(xì)胞內(nèi)的胞內(nèi)酶。利用胞內(nèi)酶時(shí)，需要采用手段將細(xì)胞破碎后，將酶進(jìn)行分離純化，提取后酶的活性和穩(wěn)定性往往都受到很大的影響。
將微生物細(xì)胞限制或定位于特定空間位置，即將微生物制成固定化細(xì)胞后，既能避免復(fù)雜的細(xì)胞破碎、酶的提取和純化過程，又能使酶的活性和穩(wěn)定性得到較大提高。固定后的微生物細(xì)胞可以作為固體催化劑在多步酶促反應(yīng)中發(fā)揮連續(xù)催化作用，同時(shí)，催化反應(yīng)結(jié)束后又能被回收和重復(fù)利用。優(yōu)點(diǎn)：制備容易、酶的活性高且穩(wěn)定。
2、固定化活細(xì)胞的制備主要方法：包埋法。將微生物細(xì)胞用物理方法包埋多微也載體內(nèi)部。凝膠包埋是最常用的方法，凝膠種類有瓊脂、海藻酸鈉（鈣）、角叉菜聚糖、明膠和聚丙烯酰胺凝膠。
目前常用海藻酸鈣包埋法，其基本原理是：先將水溶性的海藻酸鈉配成水溶液，并把細(xì)胞分散在其中，然后將其滴入凝固浴中(常用CaCl2溶液)，使海藻酸鈉中Na+的部分被Ca2+所取代而形成由多價(jià)離子交聯(lián)的離子網(wǎng)絡(luò)凝膠。這種方法操作簡(jiǎn)便，條件溫和，對(duì)細(xì)胞無毒性，適合于生長(zhǎng)細(xì)胞的固定化。但磷酸鹽會(huì)使凝膠結(jié)構(gòu)破壞，在使用時(shí)應(yīng)控制好培養(yǎng)基中磷酸鹽的濃度，并要在培養(yǎng)基中保持一定濃度的鈣離子，以維持凝膠結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。
3、比較直接使用酶、固定化酶和固定化細(xì)胞催化的優(yōu)缺點(diǎn)。
類型優(yōu)點(diǎn)不足
直接
使用酶催化效率高，低耗能，低污染對(duì)環(huán)境非常敏感，易失活；難回收，不能再次利用，與產(chǎn)物混在一起，可能影響產(chǎn)品質(zhì)量
固
定
化
酶(1)極易將固定化酶與底物、產(chǎn)物分開；產(chǎn)物溶液中沒有酶的殘留，簡(jiǎn)化了提純工藝。
(2)可以在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)反復(fù)使用，有利于工藝的連續(xù)化、管道化。
(3)酶反應(yīng)過程可以嚴(yán)格控制，有利于工藝自動(dòng)化和微電腦化。
(4)在絕大多數(shù)情況下提高了酶的穩(wěn)定性。
(5)較能適應(yīng)于多酶反應(yīng)。
(6)酶的使用效率提高，產(chǎn)物得率提高，產(chǎn)品質(zhì)量有保障，成本低。(1)酶固定化時(shí)酶的活力有所損失。同時(shí)也增加了固定化的成本，使工廠開始投資大。
(2)比較適應(yīng)水溶性底物和小分子底物。
(3)與完整細(xì)胞比較，不適于多酶反應(yīng)，特別是需要輔因子的反應(yīng)，同時(shí)對(duì)胞內(nèi)酶需經(jīng)分離后，才能固定化。
（4）一種酶只能催化一種化學(xué)反應(yīng)，生產(chǎn)實(shí)踐中，很多產(chǎn)物的形成是通過一系列的酶促反應(yīng)得到的。
固
定
化
細(xì)
胞(1)省去了酶的分離手續(xù)．為多酶系統(tǒng)，無須輔因子再生。
(2)細(xì)胞生長(zhǎng)快、而且多、反應(yīng)快。
(3)可以連續(xù)發(fā)酵，節(jié)約了成本，而且在蒸餾和提取前不用分離去細(xì)胞，能一邊徘出發(fā)酵液，一邊進(jìn)行培養(yǎng)，排除了產(chǎn)物抑制和消耗。
(4)保持酶在細(xì)胞內(nèi)的原始狀況，增加了酶的穩(wěn)定、特別是對(duì)污染因子的抵抗力增加。(1)必須保持菌體的完整，防止菌體自溶，否則，將影響產(chǎn)品純度。
(2)必須防止細(xì)胞內(nèi)蛋白酶對(duì)所需酶的分解，同時(shí)，需抑制胞內(nèi)其他酶的活性止副產(chǎn)物的形成。
(3)細(xì)胞膜、壁會(huì)阻礙底物滲透和擴(kuò)散。

【典題演示2】
1. 下列說法不正確的是 （ ）
A．葡萄糖與固定化葡萄糖異構(gòu)酶接觸，轉(zhuǎn)化成的是果糖
B．從固定化酶反應(yīng)柱下端流出的是果糖
C．高果糖漿不會(huì)像蔗糖那樣誘發(fā)肥胖、糖尿病、齲齒和心血管疾病
D．酶溶解于葡萄糖溶液后，可從糖漿中回收
【答案】D
【解析】正確區(qū)別固定化酶與酶制劑是關(guān)鍵。葡萄糖異構(gòu)酶催化葡萄糖轉(zhuǎn)化為果糖；在反應(yīng)柱上方流進(jìn)葡萄糖溶液，下方流出果糖；果糖和蔗糖相比較具有很多優(yōu)點(diǎn)；酶不會(huì)溶解在反應(yīng)液中，因?yàn)樗�被固定在載體材料中。
【變式訓(xùn)練4】
1.關(guān)于固定化酶和一般酶制劑在應(yīng)用效果上的說法錯(cuò)誤的是 ( )
A．固定化酶生產(chǎn)活性強(qiáng)，可長(zhǎng)久使用
B．一般酶制應(yīng)用后和產(chǎn)物混在一起，產(chǎn)物的純度不高
C．一般酶制劑參加反應(yīng)后不能重復(fù)利用
D．固定化酶可以反復(fù)利用，降低生產(chǎn)成本，提高產(chǎn)量和質(zhì)量
【答案】A
【解析】區(qū)分固定化酶與酶制劑是本題的解題突破口。該題主要考查了固定化酶的優(yōu)點(diǎn)，即應(yīng)用后易與產(chǎn)物分離，提高產(chǎn)品質(zhì)量；可以反復(fù)利用，降低生產(chǎn)成本。但是固定化酶作為生物催化劑，具有一定的生物活性。隨著時(shí)間的推移，酶的活性會(huì)降低，甚至消失，即固定化酶不能長(zhǎng)久使用。例如：生產(chǎn)高果糖漿的固定化酶一般只能連續(xù)使用半年。
【變式訓(xùn)練5】試分析下圖中，哪一種與用海藻酸鈉作載體制備的固定化酵母細(xì)胞相似（ ）


【答案】D。
【解析】本題主要考查酶固定和細(xì)胞固定的相關(guān)知識(shí)�？季V中的能力要求是A級(jí)。區(qū)分酶固定和細(xì)胞固定的方法是本題的解題突破口。解析過程：A是吸附法，常用于將酶固定；B是載體結(jié)合法多用于酶的固定；C和D是包埋法，C一般是將酶包埋在微網(wǎng)絡(luò)里，D是包埋在凝膠中。制備固定化酵母用的是包埋法，即將酵母菌包埋在海藻酸鈉制成的凝膠中，所以與D相似。

三 制備固定化酵母細(xì)胞并進(jìn)行酒精發(fā)酵
1.制備固定化酵母細(xì)胞流程
2.制備固定化酵母細(xì)胞主要操作過程
（1）酵母細(xì)胞的活化。在缺水的狀態(tài)下，微生物會(huì)處于休眠狀態(tài)。活化就是讓處于休眠狀態(tài)的微生物重新恢復(fù)正常的生活狀態(tài)。酵母細(xì)胞所需要的活化時(shí)間較短，一般需要O．5～1 h，要提前做好準(zhǔn)備。此外，酵母細(xì)胞活化時(shí)體積會(huì)變大，因此活化前應(yīng)該選擇體積足夠大的容器，以避免酵母細(xì)胞的活化液溢出容器外。
（2）海藻酸鈉溶液的配制和使用：對(duì)海藻酸鈉溶化時(shí)要用小火或間斷加熱，避免海藻酸鈉發(fā)生焦糊；溶化后先冷卻至室溫，再與酵母細(xì)胞混合，避免高溫殺死酵母細(xì)胞；固定化酵母細(xì)胞時(shí)，應(yīng)將海藻酸鈉酵母細(xì)胞的混合液用注射器緩慢滴加到CaCl2溶液中，而不是注射。海藻酸鈉的濃度涉及到固定化細(xì)胞的質(zhì)量。如果海藻酸鈉濃度過高，將很難形成凝膠珠；如果濃度過低，形成的凝膠珠所包埋的酵母細(xì)胞的數(shù)目少影響實(shí)驗(yàn)效果。
（3）CaCl2的作用是使海藻酸鈉膠體發(fā)生聚沉，形成凝膠珠。剛形成的凝膠珠應(yīng)在CaCl2溶液中浸泡一段時(shí)間，以便形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。
（4）凝膠珠的檢測(cè)：穩(wěn)定30min以后，一是用鑷子夾起一個(gè)凝膠珠放在實(shí)驗(yàn)桌上用手?jǐn)D壓，如果凝膠珠不容易破裂，沒有液體流出，就表明凝膠珠制作成功。二是在實(shí)驗(yàn)桌上用力摔打凝膠珠，如果凝膠珠很容易彈起，也能表明制備的凝膠珠是成功的。
【典題演示3】1．（2010江蘇）右圖1表示制備固定化酵母細(xì)胞的有關(guān)操作，圖2是利用固定化酵母細(xì)胞進(jìn)行酒精發(fā)酵的示意圖。下列敘述正確的是

A．剛?cè)芑�的海藻酸鈉應(yīng)迅速與活化的酵母菌混合制備混合液
B．圖1中X溶液為CaCl2溶液，其作用是使海藻酸鈉形成凝膠珠
C．圖2發(fā)酵過程中攪拌的目的是為了使培養(yǎng)液與酵母菌充分接觸
D．圖1中制備的凝膠珠用蒸餾水洗滌后再轉(zhuǎn)移到圖2裝置中
【答案】BCD
【解析】正確掌握準(zhǔn)備固定酵母細(xì)胞的方法和意義是關(guān)鍵。搞清固定過程所涉及的材料，明確酒精發(fā)酵的流程及操作意義。
【變式訓(xùn)練6】
1、（09屆鹽城市摸底）下列有關(guān)固定化酵母細(xì)胞制備步驟正確的是 ( )
A．應(yīng)使干酵母與自來水混合并攪拌，以利于酵母菌活化
B．配制海藻酸鈉溶液時(shí)要用小火間斷加熱的方法
C．向剛?cè)芑�好的海藻酸鈉溶液中加入已活化的酵母細(xì)胞，充分?jǐn)嚢璨⒒旌暇鶆?br>D．將與酵母細(xì)胞混勻的海藻酸鈉液注入CaCl2溶液中，會(huì)觀察到CaCl2溶液中有球形或橢珠形的凝膠形成
【答案】B。
【解析】本題主要考查固定化酵母細(xì)胞的相關(guān)知識(shí)�？季V中的能力要求是B級(jí)。掌握固定化酵母細(xì)胞的方法和步驟是本題的解題突破口。解析過程：由于在缺水狀態(tài)下，微生物處于休眠狀態(tài)，為了加速酵母細(xì)胞的活化，將干酵母與蒸餾水混合后應(yīng)用玻璃棒充分?jǐn)嚢琛�為避免海藻酸鈉發(fā)生焦糊，溶化時(shí)要小火間斷加熱。如果將剛?cè)芑�好的海藻酸鈉與已活化的酵母細(xì)胞混合，有可能會(huì)殺死酵母細(xì)胞。將與酵母細(xì)胞混勻的海藻酸鈉用注射器緩慢滴加到CaCl2溶液中，而不是注入。
【變式訓(xùn)練7】.（2009通州調(diào)研）固定化酶是從20世紀(jì)60年代迅速發(fā)展起來的一種技術(shù)。東北農(nóng)業(yè)大學(xué)科研人員利用雙重固定法，即采用戊二醛作交聯(lián)劑（使酶相互連接），海藻酸鈉作為包埋劑來固定小麥酯酶，研究固定化酶的性質(zhì)，并對(duì)其最佳固定條件進(jìn)行了探究。下圖顯示的是部分研究結(jié)果（注：酶活力為固定化酶催化化學(xué)反應(yīng)的總效率，包括酶活性和酶的數(shù)量），分析回答：

（1）從對(duì)溫度變化適應(yīng)性和應(yīng)用范圍的角度分析，甲圖所示結(jié)果可以得出的結(jié)論是______。
（2）乙圖曲線表明濃度為________的海藻酸鈉包埋效果最好，當(dāng)海藻酸鈉濃度較低時(shí)，酶活力較低原因是___________。
（3）固定化酶的活力隨使用次數(shù)的增多而下降，由丁圖可知，固定化酯酶一般可重復(fù)使用______次，酶活力明顯下降。
（4）固定小麥酯酶不采用海藻酸鈉直接包埋，同時(shí)用戊二醛作交聯(lián)劑，這是因?yàn)開______。
【答案】（1）固定化酯酶比游離酯酶對(duì)溫度變化適應(yīng)性更強(qiáng)且應(yīng)用范圍較廣 （2）3% 海藻酸鈉濃度較低時(shí)包埋不緊密，酶分子容易漏出，數(shù)量不足 （3）3 （4）酶分子很小，很容易從包埋材料中漏出
【解析】理解利用固定化酶的制作、工作原理、優(yōu)缺點(diǎn)是解決本題的突破口。固定化酶應(yīng)用后易與產(chǎn)物分離，提高產(chǎn)品質(zhì)量；可以反復(fù)利用，降低生產(chǎn)成本。但是固定化酶作為生物催化劑，具有一定的生物活性。隨著時(shí)間的推移，酶的活性會(huì)降低，甚至消失，即固定化酶不能長(zhǎng)久使用。
【備用】3.（09江蘇卷）酶解法制備原生質(zhì)體的原理是利用酶溶液對(duì)細(xì)胞壁成分的降解作用。蝸牛酶液從蝸牛（以植物為食）消化腺中提��；果膠酶、纖維素酶從微生物中提取。為了研究不同酶液的酶解效果，某實(shí)驗(yàn)小組取無菌煙草幼葉，切成相同大小的小片，等量放入6支試管中，試劑用量和實(shí)驗(yàn)結(jié)果列于下表。請(qǐng)回答有關(guān)問題。
試管編號(hào)
項(xiàng)目IⅡⅢⅣVⅥ
蒸餾水（mL）2O1111
緩沖液（mL）0210.50.50.5
果膠酶液（mL）O0O0.5O0
蝸牛酶液（mL）O0OO0.50
纖維素酶液（mL）0O0O00.5
實(shí)驗(yàn)結(jié)果（綠色深淺程度）－－－+++++++++

（注：“+”越多表示綠色越深，“一”表示顏色無顯著變化）
（1）實(shí)驗(yàn)過程中，需要輕搖試管，其目的是 ，使原生質(zhì)體從葉小片中游離出來，以便觀察懸浮液綠色的深淺。
（2）從綠色的深淺可推測(cè)：蝸牛酶液酶解效果最好，原因是蝸牛酶液含有 等多種酶。該實(shí)驗(yàn)中 是空白對(duì)照組，其設(shè)置意義是 。
（3）用網(wǎng)篩過濾原生質(zhì)體到離心管內(nèi)，離心后收集沉淀物，并用 洗滌。
（4）原生質(zhì)體是否符合要求還需進(jìn)行檢驗(yàn)，其檢驗(yàn)的方法是 。
【答案】（1）為了使細(xì)胞壁與酶充分接觸，提高酶解效果（2）果膠酶和纖維素酶 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 排除無關(guān)變量的干擾 （3）等滲溶液 （4）低滲漲破法
【解析】本題考查有關(guān)酶的催化效率的實(shí)驗(yàn)，（1）實(shí)驗(yàn)過程中，需要輕搖試管，可以使細(xì)胞壁與酶充分接觸，可以提高酶解效果（2）蝸牛以植物為食，所以唾液酶中含有果膠酶和纖維素酶，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ沒有添加酶溶液為空白對(duì)照組。其目的是排除無關(guān)變量的干擾。（3）離心后收集沉淀物，并用等滲溶液清洗，目的是保持細(xì)胞正常形態(tài)。（4）要用低滲漲破法來檢驗(yàn)原生質(zhì)體是否符合要求，若沒有細(xì)胞壁則可以漲破，有則不能漲破。
【總結(jié)提升】
1、固定酶的方法可分為三類：載體結(jié)合法(包括共價(jià)鍵結(jié)合法、離子結(jié)合法、物理吸附法)、交聯(lián)法和包埋法。
2、固定酶的優(yōu)點(diǎn)：可以重復(fù)多次使用，和反應(yīng)物分離提純?nèi)菀住?br>3、固定酶的缺點(diǎn)：只能催化單一反應(yīng)，固定過程會(huì)對(duì)酶的活性產(chǎn)生影響。
4、固定細(xì)胞的方法：包埋法，用海藻酸鈉包埋。
5、海藻酸鈉小火融化防止燒糊，酵母菌要加水活化，溶化的海藻酸鈉要冷卻至室溫加入活化的酵母菌攪拌均勻。
6、CaCl2的作用是使海藻酸鈉膠體發(fā)生聚沉，形成凝膠珠。

本文來自：逍遙右腦記憶 http://www.portlandfoamroofing.com/gaosan/68118.html

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